Molecular clonazione Protocolli

Molecular clonazione Protocolli


protocolli di clonazione molecolare comprendono le procedure utilizzate per la definizione, l'isolamento e la replica di una sequenza di DNA. protocolli di restrizione e la legatura di clonazione tradizionali iniziano frammentazione del DNA con endonucleasi limitato (enzimi che tagliano i filamenti di DNA in siti di restrizione), frammento di DNA legatura (la riparazione di discontinuità in molecole di DNA), trasfezione (l'introduzione di acido nucleico in un corpo cellulare) e la selezione (la scelta di genomi individuali per la replica).

Isolamento

Protocolli per l'isolamento di un frammento di DNA, il primo passo nella clonazione molecolare, spesso incorporano una reazione a catena della polimerasi (PMR), che utilizza cicli di riscaldamento e raffreddamento per amplificare frammenti di DNA. Per raggiungere la dimensione sequenza obiettivo, altri protocolli includono sonicazione DNA, reazione enzimatica digestione e l'uso di oligonucleotidi sintetizzati chimicamente. Questi protocolli variano a seconda della grandezza e la quantità di DNA isolata necessario.

legatura

Protocolli per la legatura coinvolgono utilizzando un enzima, DNA ligasi, per unirsi molecole di DNA con un legame covalente. Protocollo dettami unendo frammenti di DNA, il vettore di clonaggio, un tampone legatura, la ligasi del DNA e acqua sterilizzata in una provetta e incubando overnight a 4 gradi Celsius.

trasfezione

Protocolli per trasfezione, o DNA infondendo in una cella utilizzando un mezzo non virali, spesso coinvolgono l'iniezione di DNA direttamente nel citoplasma delle cellule. Altri metodi includono l'utilizzo di reagenti chimici, come fosfato di calcio e lipidi, per fornire il complesso trasfezione attraverso la membrana cellulare. Questo metodo verifica gli effetti della modificazione genetica sul funzionamento di geni specifici.

Selezione

Selezione, o lo screening, protocolli determinano quali cellule svolta con successo l'inserto di DNA ed indicano che le cellule hanno bisogno di isolamento. Un raccolti centrifuga cellule che contengono il DNA trasfettato, che vengono poi incubate in un lisozima (un enzima naturale) buffer e trattati con un detergente alcalino, dando la proteine ​​e membrane solubilità. Utilizzando acetato per precipitare le proteine, un filtro centrifuga e garza il surnatante DNA contenente (il liquido solubile rimanente da un composto centrifugato). Il supernatante viene precipitato con polietilene glicole, centrifugato, e sospesa in tampone di cloruro di cesio e bromuro di etidio. Il bromuro di etidio macchie il DNA in base alla densità e utilizzando una luce UV ad onda lunga, il DNA-fascia inferiore viene estratto con una siringa cinque cc. Una colonna di scambio ionico equilibrata separa il DNA dal cloruro di bromuro di etidio e cesio, e il pellet di DNA finale viene sospeso in una soluzione tampone e rilevato sulla elettroforesi su gel di agarosio.